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La production ou synthèse chimique de gènes est un pilier essentiel de la biologie moléculaire moderne, permettant de produire des gènes natifs complets et de nouveaux gènes (ceux qui n'existent pas naturellement). De plus, ce processus est à la base de la production de génomes entiers (l'ensemble complet des instructions génétiques présentes dans une cellule vivante).
Les progrès des de synthèse génique offrent aujourd'hui aux chercheurs diverses méthodes de production de gènes. Cependant, chaque méthode a son application spécifique, la synthèse de gènes particuliers, et aucune technique n'est interchangeable. Vous trouverez donc ci-dessous un aperçu des techniques de synthèse génique courantes et de leurs caractéristiques afin de vous guider dans le choix de la méthode la plus adaptée à vos projets.
La production de gènes synthétiques est un processus par étapes qui permet de produire un gène et d'autres produits géniques sans recourir à une matrice d'ADN. Elle facilite ainsi la production de gènes divers, y compris des gènes personnalisés avec des séquences ou des paires de bases modifiées.
Comme indiqué précédemment, les progrès de la biotechnologie ont permis le développement de nombreuses techniques de production de gènes synthétiques. Cependant, toutes ces techniques s'inspirent du processus naturel de production de gènes des organismes vivants, avec quelques modifications mineures.
Par conséquent, la compréhension du processus de synthèse génique de base permet d'apprécier les nuances entre les différentes techniques de synthèse. Vous trouverez ci-dessous un aperçu des étapes de la synthèse génique.
Les oligonucléotides sont de courts brins d'acide nucléique (ADN ou ARN) qui constituent les éléments de base de la production de tout produit génique, notamment la synthèse de peptides et de protéines. Différentes méthodes de synthèse génique utilisent différents réactifs et techniques pour initier la synthèse des oligonucléotides. Cependant, le processus se déroule toujours dans le sens 3' → 5'.
L'hybridation consiste à chauffer des molécules comme les oligonucléotides avant de les refroidir progressivement afin de faciliter l'hybridation, c'est-à-dire la formation d'une liaison chimique entre deux molécules. Différentes méthodes de synthèse génique utilisent des techniques d'annihilation spécifiques pour former une séquence génique complète.
Le clonage consiste à répliquer des copies de la séquence génétique nouvellement formée à l'aide d'un vecteur de clonage.
La synthèse génique n'est pas un processus parfait. C'est pourquoi le criblage de clones est nécessaire pour identifier le gène cible parmi eux. Les kits ELISA et la chromatographie sont des outils de criblage couramment utilisés.
Outre l'identification du gène cible, une analyse approfondie des paires de bases de la séquence est nécessaire. De plus, des mesures correctives visant à rectifier les erreurs de réplication, telles que les délétions et les substitutions de bases, garantissent un positionnement correct du plasmide.
Vous trouverez ci-dessous un aperçu des méthodes et applications de synthèse génétique les plus courantes.
La synthèse en phase solide est une méthode classique de synthèse génique qui utilise des nucléosides chimiquement modifiés, notamment des acides nucléiques verrouillés (LNA), pour synthétiser des oligonucléotides cibles. Une colonne de réactif contenant un acide de déprotection retient les nucléosides qui forment progressivement une chaîne oligonucléotidique par déprotection successive des nucléosides.
Le processus d'assemblage enzymatique comprend le déblocage (déprotection) des nucléosides, suivi du couplage, du blocage et de l'oxydation pour former une séquence génique à partir des oligonucléotides nouvellement synthétisés. La synthèse en phase solide est un processus entièrement automatisé, et les chercheurs récupèrent les gènes à la fin. Parmi ses avantages figure une précision remarquable des séquences géniques obtenues.
Cependant, la déprotection accroît le risque de réactions secondaires, et ce risque augmente avec la longueur du gène. C'est pourquoi la synthèse en phase solide ne produit que des gènes de 15 à 25 bases (200 nucléotides maximum). Ces gènes trouvent des applications en biologie moléculaire et en médecine, notamment comme oligonucléotides antisens dans la synthèse protéique ou comme sondes pour la détection de matériel génétique complémentaire.
La synthèse d'ADN sur puce est un procédé de synthèse génétique de nouvelle génération. Contrairement à la synthèse en phase solide, qui est un procédé chimique, la synthèse sur puce est un procédé électrochimique.
Cette méthode utilise des puces semi-conductrices à microréseaux équipées de systèmes de contrôle de la température pour générer plusieurs oligonucléotides en une seule étape. La synthèse sur puce complète le procédé chimique traditionnel du cycle des phosphoramidites en créant des zones à température contrôlée, appelées puits/îlots virtuels, ce qui améliore la sélectivité.
De plus, elle facilite la détection et la correction des erreurs lors de l'assemblage des oligonucléotides et ne nécessite pas d'étape distincte d'analyse de séquence et de correction d'erreurs. La synthèse sur puce présente l'avantage d'un débit élevé et de la capacité de générer des fragments de gènes avec des paires de bases plus longues. Cette technique produit des séquences géniques pour des applications exigeant un volume d'ADN cible important et une précision moindre.
La synthèse génique par PCR (réaction en chaîne par polymérase) est un procédé classique qui produit des millions de fragments de gènes en deux étapes utilisant des amorces. La première étape consiste à assembler des nucléotides chevauchants par une réaction en chaîne auto-amorcée pour générer un oligonucléotide de 60 paires de bases, couvrant la séquence entière.
Dans un second temps, une réaction PCR génère des fragments d'ADN de 400 à 500 pb. Une amorce supplémentaire amplifie le fragment d'ADN cible. Cette méthode est idéale pour les applications nécessitant des fragments de gènes longs et de haute précision.
La synthèse de gènes par puces à ADN est sans doute le procédé de production de gènes le plus économique grâce à sa faible consommation de réactifs. De plus, cette méthode permet une synthèse multiplexée, produisant des milliers, voire des dizaines de milliers, de séquences d'oligonucléotides.
Cependant, si la diversité des séquences d'oligonucléotides constitue un atout, leur assemblage en fragments de gènes fonctionnels s'avère complexe en raison de l'homologie de séquence. Par conséquent, cette méthode est idéale pour les processus de synthèse génique personnalisés nécessitant des quantités bien moindres de fragments de gènes.
La synthèse génique en phase liquide est également une technique classique, similaire à bien des égards à la synthèse en phase solide. Cependant, contrairement à cette dernière, la génération d'oligonucléotides se déroule en solution et non sur un support en colonne. De plus, la synthèse génique en phase liquide présente un risque moindre de réactions de chaînes latérales et permet de générer de longs fragments d'ADN avec un minimum d'erreurs, bien que plus lentement.
Les techniques de synthèse génique évoluent constamment pour répondre à la demande croissante de gènes de haute qualité, à la rentabilité et à l'extensibilité. Les méthodes présentées ci-dessus constituent les principales méthodes de production de gènes ; n'hésitez pas à consulter votre prestataire de services pour déterminer la méthode la plus adaptée à votre projet et à votre budget.
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